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第51课时　微生物的培养技术及应用
1．阐明无菌技术是在操作过程中，保持无菌物品和无菌区域不被微生物污染的技术。2.举例说明通过调整培养基的配方可有目的地培养某种微生物。3.概述平板划线法和稀释涂布平板法是实验室中进行微生物分离和纯化的常用方法。4.概述稀释涂布平板法和显微镜计数法是测定微生物数量的常用方法。
考点一　微生物的基本培养技术
1．培养基的配制
(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。
(2)用途：用以培养、分离、鉴定、保存微生物或积累其代谢物。
(3)培养基的种类（按物理性质分）
培养基种类 培养基特点 作用
固体培养基 加凝固剂，如琼脂 微生物的分离与鉴定，活菌计数，保藏菌种
半固体培养基 容器放倒不致流出，剧烈震动则破散 观察微生物的运动、分类鉴定
液体培养基 不加凝固剂 常用于工业生产、微生物的扩大培养
(4)营养组成
①成分
成分 含义 作用 来源
碳源 提供碳元素的物质 构成生物体的细胞的物质和一些代谢物，有些也是异养生物的能源物质 无机碳源：CO2、 NaHCO3等； 有机碳源：糖类、牛肉膏等
氮源 提供氮元素的物质 合成蛋白质、核酸等物质 无机氮源：N2、NH3、铵盐、硝酸盐等； 有机氮源：蛋白胨等
无机盐 为微生物提供除了碳、氮之外的各种重要元素，包括大量元素和微量元素 为微生物提供无机营养，调节培养基的pH等 无机化合物： KH2PO4、K2HPO4、NaCl等
水 生物体含量最高的无机化合物 良好的溶剂，参与化学反应等 培养基、代 谢物
②在提供上述几种主要营养物质的基础上，还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质以及O2的需求。
微生物 对培养基的需求
乳酸杆菌 添加维生素
霉菌 一般将培养基调至酸性
细菌 一般将培养基调至中性或弱碱性
厌氧微生物 提供无氧的条件
2.无菌技术
(1)目的：获得纯净的培养物。
(2)关键：防止杂菌污染。
(3)消毒和灭菌
比较项目 条件 结果 常用方法 应用范围
消毒 较为温和的物理、化学或生物等方法 仅杀死物体表面或内部一部分微生物（不包括芽孢和孢子） 煮沸消毒法 日常用品
巴氏消毒法 不耐高温的液体
化学药物消毒法 操作空间、操作者的衣物和手等
紫外线 消毒法 接种室、接种箱或超净工作台
灭菌 强烈的理化方法 杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子 湿热灭菌法 培养基、容器等
干热灭菌法 玻璃器皿、金属用具等
灼烧灭菌法 接种工具等
3.微生物的纯培养概念辨析
4．纯培养的过程（以酵母菌为例）：包括配制培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。
(1)制备培养基
倒平板注意事项：①温度：50 ℃左右；②操作：在酒精灯火焰附近；③冷凝后平板倒置。
平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，将平板倒置，既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，又可以避免培养基中的水分过快挥发。
(2)接种和分离酵母菌
①平板划线法的原理：通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。经数次划线后培养，可以分离得到单菌落。
②平板划线法的操作步骤
(3)培养酵母菌
将接种后的平板和一个未接种的平板倒置，放入28 ℃左右的恒温培养箱中培养24～48 h。
(1)不含氮源的平板不能用于微生物培养。（2023·山东卷）(　×　)
(2)接种后未长出菌落的培养基可以直接丢弃。（2023·山东卷）(　×　)
(3)培养细菌时，可选用牛肉膏蛋白胨固体培养基。（2022·海南卷）(　√　)
(4)用作培养基的草本植物给食用菌提供碳源和氮源。（2021·北京卷）(　√　)
(5)将培养基倒入培养皿后，应立即将培养皿倒过来放置。(　×　)
(6)配制培养基时应先灭菌再调pH。(　×　)
(7)（选择性必修3 P10“旁栏思考”）无菌技术除用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还具有能有效避免操作者自身被微生物感染的作用。
(8)（选择性必修3 P10正文）所有微生物的培养基中都需要加入碳源、氮源吗？
提示：自养微生物能利用无机碳源（比如空气中的CO2），培养基中不用添加碳源；固氮微生物可利用N2作为氮源，培养基中不用加入氮源。
【情境应用】甲、乙两位同学学习完微生物的实验室培养后，要利用所学知识研究水中微生物的情况。
Ⅰ.甲同学为了检测饮用水中是否含有某种细菌，配制如下培养基进行培养：
蛋白胨 10 g
乳糖 5 g
蔗糖 5 g
K2HPO4 2 g
蒸馏水 1 000 mL
将pH调到7.2
【问题探究】
(1)该培养基所含有的碳源有蔗糖、乳糖、蛋白胨，其功能是主要用于提供能量以及构成微生物的细胞物质和代谢物。
(2)该培养基所含有的氮源有蛋白胨，其功能是主要用于合成蛋白质、核酸及含氮的代谢物。
(3)用该培养基培养微生物时，还需要控制哪些理化条件？
提示：温度、氧气浓度和pH等。
Ⅱ.乙同学为了调查湖水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、平板划线接种及培养、菌落观察。
【问题探究】
(4)对培养基进行灭菌时，应该采用的方法是高压蒸汽灭菌。
(5)用图中字母和箭头表示平板划线操作的正确步骤：d→b→f→a→e→c→h→g。
(6)在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
提示：需要。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免污染环境和感染操作者。
(7)在第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
提示：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。
(8)接种结束后，为什么要将一个未接种的培养基和一个已接种的培养基放在一起培养，未接种的培养基表面如果有菌落生长，说明了什么？
提示：培养未接种的培养基的作用是对照，未接种的培养基经过培养后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的；若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底，或培养基被污染了，需要重新制备。
考向1 围绕无菌技术考查科学探究、社会责任
1．（2022·湖北卷）灭菌、消毒、无菌操作是生物学实验中常见的操作。下列叙述正确的是(　D　)
A．动、植物细胞DNA的提取必须在无菌条件下进行
B．微生物、动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染
C．为防止蛋白质变性，不能用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌
D．可用湿热灭菌法对实验中所使用的微量离心管、细胞培养瓶等进行灭菌
解析：动、植物细胞DNA的提取不需要在无菌条件下进行，A错误；动物细胞培养基中需添加一定量的抗生素以防止污染，保证无菌环境，而微生物的培养不能加入抗生素，B错误；一般用湿热灭菌法对牛肉膏蛋白胨培养基进行灭菌，以防止杂菌污染，C错误。
2．（2025·江苏镇江开学考）防止杂菌污染是获得纯净的微生物培养物的关键。下列叙述错误的是(　C　)
A．利用微生物能够寄生于多种细菌体内使细菌裂解，可实现生物消毒
B．利用紫外线对超净工作台进行消毒前，喷洒消毒液可加强消毒效果
C．利用干热灭菌箱对培养基进行灭菌时，应在160～170 ℃的热空气中维持1～2 h
D．利用酒精灯对金属用具进行灼烧灭菌时，应在酒精灯火焰充分燃烧层进行
解析：应用高压蒸汽灭菌法对培养基进行灭菌，C错误。
考向2 围绕微生物的纯培养考查科学思维、科学探究
3．（2024·湖南卷）微生物平板划线和培养的具体操作如图所示，下列操作正确的是(　D　)
A.①②⑤⑥ B．③④⑥⑦
C．①②⑦⑧ D．①③④⑤
解析：由题图可知，②中拔出棉塞后应握住棉塞上部；⑥中划线时不能将培养皿的皿盖完全打开，应只打开一条缝隙；⑦中划线时第5次的划线不能与第1次的划线相连；⑧中平板应倒置培养。①③④⑤正确。
4．为纯化菌种，在鉴别培养基上划线接种纤维素降解细菌，培养结果如图所示。下列叙述正确的是(　B　)
A．倒平板后需间歇晃动，以保证表面平整
B．图中Ⅰ、Ⅱ区的细菌数量均太多，应从Ⅲ区挑取单菌落
C．该实验结果因单菌落太多，不能达到菌种纯化的目的
D．菌落周围的纤维素被降解后，可被刚果红染成红色
解析：倒平板后无须间歇晃动，A错误；由题图可知，随着划线次数增多，细菌密度逐渐减小，Ⅲ区开始出现单菌落，应从Ⅲ区挑取单菌落，B正确；该实验的Ⅲ区已经出现由单个细菌繁殖而形成的菌落，因此已经达到菌种纯化的目的，C错误；刚果红能与纤维素形成红色复合物，菌落周围的纤维素被降解后红色消失，出现透明圈，D错误。
考点二　微生物的选择培养和计数
1．选择培养基
2．微生物的选择培养
(1)取样：铲取土样，将样品装入纸袋中。
(2)稀释涂布平板法的步骤
①系列稀释操作：将10 g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀。取1 mL上清液加入盛有9 mL无菌水的试管中，依次等比稀释。
②涂布平板操作
3．微生物的数量测定
(1)利用稀释涂布平板法计数
①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个单菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。
②计数标准：为了保证结果准确，一般选择菌落数为30～300、适于计数的平板进行计数，并且在同一稀释度下，应至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，增强实验的说服力与准确性。
③计数方法：用此种方法统计的菌落数往往比活菌的实际数目少，这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是用活菌数来表示。
(2)显微镜直接计数法
4．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
(1)实验原理
(2)操作步骤
(3)实验结果分析与评价
5．分解纤维素的微生物的分离
(1)分离方法与原理
(2)纤维素分解菌的培养基成分及鉴定原理
(1)平板涂布时涂布器使用前必须进行消毒。（2023·山东卷）(　×　)
(2)利用以尿素为唯一氮源的平板能分离出合成脲酶的微生物。（2023·山东卷）(　√　)
(3)稀释涂布平板法计数时，统计的菌落数往往比活菌的实际数目少。(　√　)
(4)测定土壤中细菌的数量，一般选用1×102、1×103、1×104倍数的稀释液进行平板培养。(　×　)
(5)以未接种的培养基为对照组，可判断选择培养基是否具有选择作用。(　×　)
(6)在含有刚果红的培养基上，纤维素分解菌菌落周围会出现抑菌圈。(　×　)
(7)在某一浓度下涂布三个平板，若三个平板统计的菌落数差别不大，则应以它们的平均值作为统计结果。(　√　)
(8)（选择性必修3 P19“探究·实践”延伸思考）能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物。
考向1围绕微生物的选择培养考查科学探究
1．（2024·重庆卷）养殖场粪便是农家肥的重要来源，其中某些微生物可使氨氮化合物转化为尿素进而产生NH3，影响畜禽健康。为筛选粪便中能利用氨氮化合物且减少NH3产生的微生物。兴趣小组按图进行实验获得目的菌株，正确的是(　C　)
A．①通常在等比稀释后用平板划线法获取单个菌落
B．②挑取在2种培养基上均能生长的用于后续的实验
C．③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙
D．粪便中添加菌株甲比乙更有利于NH3的减少
解析：用平板划线法获取单个菌落时无须稀释菌液，A错误；由题图可知，②的目的是筛选不能在尿素唯一氮源培养基上生长，而能在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌株用于后续的实验，B错误；所筛选出的菌株之所以不能利用尿素，可能是由于不产生脲酶或分泌脲酶抑制剂，所以③可通过添加脲酶并检测活性，筛选得到甲、乙，C正确；由题图可知，甲不产生脲酶，乙分泌脲酶抑制剂，粪便中可能还含有其他能产生脲酶的菌株使甲能够产生NH3，所以粪便中添加菌株乙比甲更有利于NH3的减少，D错误。
两种纯化方法的比较
项目 平板划线法 稀释涂布平板法
分离结果
关键操作 接种环在固体培养基表面连续划线 一系列的梯度稀释；涂布平板操作
接种用具 接种环 涂布器
优点 可以观察菌落特征，对混合菌进行分离 可以计数，可以观察菌落特征
缺点 不能计数 操作复杂，需要涂布多个平板
共同点 都要用到固体培养基；都需进行无菌操作；都会在培养基表面形成单个的菌落；都可用于观察菌落特征
2．（2022·广东卷）研究深海独特的生态环境对于开发海洋资源具有重要意义。近期在“科学号”考察船对中国南海科考中，中国科学家采集了某海域1 146米深海冷泉附近沉积物样品，分离、鉴定得到新的微生物菌株并进一步研究了其生物学特性。
回答下列问题：
(1)研究者先制备富集培养基，然后采用高压蒸汽灭菌法灭菌，冷却后再接入沉积物样品，28 ℃厌氧培养一段时间后，获得了含拟杆菌的混合培养物，为了获得纯种培养物，除了稀释涂布平板法，还可采用平板划线法。据图分析，拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。
(2)研究发现，将采集的样品置于各种培养基中培养，仍有很多微生物不能被分离筛选出来，推测其原因可能是某些微生物只有利用深海冷泉中的特有物质才能生存（或需要在深海冷泉的特定环境中才能存活）。（答一点即可）
(3)藻类细胞解体后的难降解多糖物质，通常会聚集形成碎屑沉降到深海底部。从生态系统组成成分的角度考虑，拟杆菌对深海生态系统碳循环的作用可能是拟杆菌作为分解者，将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的顺利进行。
(4)深海冷泉环境特殊，推测此环境下生存的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，除具有酶的一般共性外，其特性可能还有耐低温。
解析：(1)培养基配制后通常采用高压蒸汽灭菌法进行灭菌。接种时，可以采用稀释涂布平板法或平板划线法，将菌种分散在固体培养基上，经过培养得到单菌落，从而获得纯种培养菌。分析图中曲线可知，在以纤维素为碳源的培养基中，细胞数量最多，可推知拟杆菌新菌株在以纤维素为碳源时生长状况最好。(2)深海冷泉中可能存在某些微生物，只有利用冷泉中的特有物质才能生存，或者只能在深海冷泉的特定环境中才能存活，故将采集的样品置于各种培养基中培养，仍可能有很多微生物不能被分离筛选出来。(3)拟杆菌为异养生物，作为深海冷泉生态系统的分解者，能将沉降到深海底部的难降解多糖物质分解为无机物，归还到无机环境中，有利于碳循环的进行。(4)深海冷泉温度较低，故生活在其中的拟杆菌所分泌的各种多糖降解酶，应具有耐低温的特性，才能高效降解多糖，保证拟杆菌的正常生命活动所需。
考向2 围绕微生物的分离和计数考查科学思维、科学探究
3．（2023·辽宁卷）细菌气溶胶是由悬浮于大气或附着于颗粒物表面的细菌形成的。利用空气微生物采样器对某市人员密集型公共场所采样并检测细菌气溶胶的浓度（菌落数/m3）。下列叙述错误的是(　D　)
A．采样前需对空气微生物采样器进行无菌处理
B．细菌气溶胶样品恒温培养时需将平板倒置
C．同一稀释度下至少对3个平板计数并取平均值
D．稀释涂布平板法检测的细菌气溶胶浓度比实际值高
解析：为防止杂菌污染，接种前需要对培养基、培养皿、微生物采样器进行灭菌，对实验操作者的双手进行消毒，A正确；纯化培养时，为防止皿盖上的水珠落入培养基和避免培养基中的水分过快蒸发，培养皿应倒置放在恒温培养箱内培养，B正确；微生物计数时在同一稀释度下，需要对至少3个菌落数目在30～300的平板进行计数，以确保实验的准确性，C正确；使用稀释涂布平板法对微生物计数，数值往往偏低，原因是两个或多个细胞连在一起时，在平板上只能观察到一个菌落，D错误。
4．（2024·全国甲卷）合理使用消毒液有助于减少传染病的传播。某同学比较了3款消毒液A、B、C杀灭细菌的效果，结果如图所示。回答下列问题：
(1)该同学采用显微镜直接计数法和菌落计数法分别测定同一样品的细菌数量，发现测得的细菌数量前者大于后者，其原因是前者活菌和死菌一起计数，后者存在多个活菌形成一个菌落的情况且只计数活菌。
(2)该同学从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，再从稀释菌液中取200 μL涂布平板，菌落计数的结果为100，据此推算细菌原液中细菌浓度为5 000个/mL。
(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止杂菌污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。
(4)据图可知杀菌效果最好的消毒液是A，判断依据是A消毒液活细菌减少量最多；杀菌时间较短，效率最高。（答出2点即可）
(5)鉴别培养基可用于反映消毒液杀灭大肠杆菌的效果。大肠杆菌在伊红—亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色。
解析：(1)显微镜直接计数法把死菌和活菌一起计数。菌落计数法只计活菌数，还可能存在多个活菌形成一个菌落的情况，故测得的细菌数量前者大于后者。(2)从100 mL细菌原液中取1 mL加入无菌水中得到10 mL稀释菌液，即稀释了10倍，1 mL细菌原液中所含细菌数量＝（菌落数÷菌液体积）×稀释倍数＝100÷(200×10-3)×10＝5 000（个），所以细菌原液中细菌浓度为5 000个/mL。(3)菌落计数过程中，涂布器应先在酒精灯上灼烧，冷却后再涂布。灼烧的目的是杀死涂布器上可能存在的微生物，防止杂菌污染，冷却的目的是防止温度过高杀死菌种。(4)A消毒液活细菌减少量最多，且杀菌时间较短，效率最高，因此A消毒液杀菌效果最好。(5)大肠杆菌在伊红—亚甲蓝培养基上生长的菌落呈深紫色。
1．（2022·辽宁卷）为避免航天器在执行载人航天任务时出现微生物污染风险，需要对航天器及洁净的组装车间进行环境微生物检测。下列叙述错误的是(　D　)
A．航天器上存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物
B．细菌形成菌膜黏附于航天器设备表面产生生物腐蚀
C．在组装车间地面和设备表面采集环境微生物样品
D．采用平板划线法等分离培养微生物，观察菌落特征
解析：航天器处于外太空的极端环境中，其上可能存在适应营养物质匮乏等环境的极端微生物，A正确；细菌形成菌膜可黏附于航天器设备表面产生生物腐蚀，故需要洁净的组装车间，B正确；在组装车间地面和设备表面可采集环境微生物样品，C正确；由于航天器及洁净的组装车间微生物很少，不需要用平板划线法分离微生物，D错误。
2．（2023·广东卷）研究者拟从堆肥中取样并筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌。根据堆肥温度变化曲线（如图）和选择培养基筛选原理来判断，下列最可能筛选到目标菌的条件组合是(　D　)
A．a点时取样、尿素氮源培养基
B．b点时取样、角蛋白氮源培养基
C．b点时取样、蛋白胨氮源培养基
D．c点时取样、角蛋白氮源培养基
解析：研究目的是筛选能高效降解羽毛、蹄角等废弃物中角蛋白的嗜热菌，因此目标菌既要耐高温，又要能够高效降解角蛋白，所以应在c点时取样，并且用角蛋白氮源培养基进行选择培养，D符合题意。
3．（2021·山东卷）含硫蛋白质在某些微生物的作用下产生硫化氢导致生活污水发臭。硫化氢可以与硫酸亚铁铵结合形成黑色沉淀。为探究发臭水体中甲、乙菌是否产生硫化氢及两种菌的运动能力，用穿刺接种的方法分别将两种菌接种在含有硫酸亚铁铵的培养基上进行培养，如图所示。若两种菌繁殖速度相等，下列说法错误的是(　B　)
A．乙菌的运动能力比甲菌强
B．为不影响菌的运动需选用液体培养基
C．该实验不能比较出两种菌产生硫化氢的量
D．穿刺接种等接种技术的核心是防止杂菌的污染
解析：从图中可以看出甲菌在试管中分布范围小于乙菌，说明了乙菌的运动能力比甲菌强，A正确；为不影响菌的运动需选用半固体培养基，B错误；该实验只能对甲、乙菌能否产生硫化氢进行定性分析，并不能比较两种菌产生硫化氢的量，C正确；微生物接种技术的核心是防止杂菌的污染，D正确。
4．（2024·海南卷）某小组为检测1株粗糙脉孢霉突变株的氨基酸缺陷类型，在相同培养温度和时间的条件下进行实验，结果见表。下列有关叙述错误的是(　D　)
组别 培养条件 实验结果
① 基础培养基 无法生长
② 基础培养基＋甲、乙、丙3种氨基酸 正常生长
③ 基础培养基＋甲、乙2种氨基酸 无法生长
④ 基础培养基＋甲、丙2种氨基酸 正常生长
⑤ 基础培养基＋乙、丙2种氨基酸 正常生长
A.组别①是②③④⑤的对照组
B．培养温度和时间属于无关变量
C．①②结果表明，甲、乙、丙3种氨基酸中有该突变株正常生长所必需的氨基酸
D．①～⑤结果表明，该突变株为氨基酸甲缺陷型
解析：与①组相比，在基础培养基中，若添加的氨基酸中含有丙种氨基酸，则粗糙脉孢霉突变株都能正常生长，但在只添加甲、乙2种氨基酸的基础培养基中无法生长，说明该突变株为氨基酸丙缺陷型，D错误。
课时作业51
（总分：50分）
一、选择题（每小题3分，共30分）
1．（2025·辽宁沈阳模拟）地衣芽孢杆菌具有调节动物肠道微生态平衡，增加动物机体抗病能力的功能。仔兔饲喂地衣芽孢杆菌20～40天后，其免疫器官生长发育迅速，血浆中T淋巴细胞值较对照组高。下列叙述错误的是(　A　)
A．培养地衣芽孢杆菌时，需要将培养基调至酸性
B．可用液体培养基对地衣芽孢杆菌扩大培养
C．使用后的培养基在丢弃前要经过灭菌处理
D．地衣芽孢杆菌改变了仔兔肠道菌群的结构
解析：地衣芽孢杆菌属于细菌，其培养基一般呈中性或弱碱性，A错误。
2．（2025·江西赣州模拟）硝化细菌在观赏鱼类养殖中发挥着重要的作用，鱼类的排泄物和未吃完的食物会转变成氨和亚硝酸，而硝化细菌可以利用氧化氨和亚硝酸时释放的能量合成有机物。若要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数，下列有关叙述错误的是(　C　)
A．可以从观赏鱼类生长良好的鱼缸中进行取样
B．筛选硝化细菌的培养基中不需要添加有机碳源
C．可用接种环连续划线、逐步稀释，进行纯化和计数
D．计数时每隔24 h统计一次，待菌落数目稳定时记录结果
解析：鱼类生长良好的鱼缸中，氮循环稳定，鱼缸中含有较多的硝化细菌可以及时将鱼的排泄物和未吃完的食物分解，因此可以从观赏鱼类生长良好的鱼缸中取样来分离硝化细菌，A正确；硝化细菌属于自养生物，可以利用空气中的CO2作碳源，B正确；要对鱼缸中的硝化细菌进行分离和计数，需要用稀释涂布平板法，平板划线法不能用于微生物的计数，C错误；对菌落进行计数，要以连续观察直至数量不再增加时的菌落数作为计数结果，D正确。
3．（2024·广东中山一模）某同学欲检测消毒餐具中大肠杆菌的数量是否超标，进行如下操作：用蒸馏水分3～5次冲洗待检餐具内表面，制成待测样液备用；配制伊红—亚甲蓝琼脂培养基，将待测样液接种于琼脂培养基上。下列叙述错误的是(　C　)
A．为了确保检测的准确性，冲洗待检餐具的蒸馏水应该换成无菌水
B．生长在伊红—亚甲蓝琼脂培养基上的大肠杆菌菌落具有金属光泽
C．设置牛肉膏蛋白胨培养基作对照可检验该鉴别培养基的效果
D．为便于观察菌落的颜色，应将培养基的pH调至中性或弱碱性
解析：蒸馏水中可能存在大肠杆菌，对检测结果产生干扰，为了确保检测的准确性，冲洗待检餐具的蒸馏水应该换成无菌水，A正确；生长在伊红—亚甲蓝琼脂培养基上的大肠杆菌菌落呈深紫色且具有金属光泽，B正确；为检验该鉴别培养基的效果，应设置接种大肠杆菌的伊红—亚甲蓝琼脂培养基作对照，C错误；大肠杆菌属于细菌，在培养细菌时，需要将培养基的pH调至中性或弱碱性，D正确。
4．（2025·河北邢台摸底）物质M是一种难以降解的含氮有机物，其在培养基中表现为不透明。某研究小组欲从土壤中分离出能降解M的微生物，取土样并进行一系列稀释后，取稀释液滴加到平板A上开始涂布，然后置于恒温箱中培养24 h，发现平板上的部分菌落周围出现透明圈，部分菌落周围未出现透明圈。下列有关分析错误的是(　C　)
A．平板A应以物质M为唯一有机氮源，属于选择培养基
B．平板A上的菌落数过多可能是取样前未将稀释液摇匀所致
C．平板A上出现了无透明圈的菌落是因为培养基被污染了
D．透明圈最大的菌落，其分解M的能力未必最强
解析：由题意可知，欲从土壤中分离出能降解M的微生物，可见平板A应以物质M为唯一有机氮源，属于选择培养基，A正确；由题干信息可知，实验采用稀释涂布平板法进行接种，平板A上的菌落数过多可能是取样前未将稀释液摇匀所致，B正确；平板A上出现了无透明圈的菌落不是因为培养基被污染了，而是细菌分解M的能力弱，C错误；透明圈直径与菌落直径的比值大小能反映该细菌对物质M的分解能力，透明圈最大的菌落，其分解M的能力未必最强，D正确。
5．（2025·重庆渝北区摸底）采用巴氏消毒法进行杀菌处理的牛奶通常被称为“巴氏杀菌乳”，某款牛奶的产品介绍如图所示。根据图中信息判断，下列说法正确的是(　D　)
A．巴氏消毒的优点是既能杀死所有微生物，又不破坏牛奶的成分
B．如果盒装牛奶出现鼓包，很可能是乳酸菌污染导致
C．鲜牛奶应保存在2～6 ℃条件下，因为在这个区间的温度能够杀死微生物
D．巴氏消毒可以破坏微生物的蛋白质结构，使其失去活性
解析：巴氏消毒法的优点是能够杀死牛奶中的大部分病原微生物，并且基本不会对牛奶的营养成分造成破坏，A错误；乳酸菌无氧呼吸不产生气体，如果被乳酸菌污染，不会使盒装牛奶出现鼓包，B错误；鲜牛奶应保存在2～6 ℃条件下，因为这个温度区间可以抑制微生物的生长和繁殖，而不是直接杀死微生物，C错误；巴氏消毒通过将牛奶加热到一定温度，可以破坏微生物的蛋白质结构，使其失去活性，从而达到杀菌的效果，D正确。
6．（2025·湖南长沙联考）聚乙烯醇（PVA，一种难以降解的大分子有机物）能与碘作用产生蓝绿色复合物，复合物被降解后呈白色，PVA分解菌能够产生PVA酶降解PVA。某实验小组从土壤样品中分离具有降解PVA功能的菌株，大致过程是①称量土样→②依次等比稀释→③涂布平板→④滴加碘液，挑取需要的单菌落转移至培养液中培养→⑤检测菌株降解PVA的能力→⑥选取优良菌株扩大培养。下列叙述正确的是(　C　)
A．制备以PVA为唯一碳源的培养基时应先灭菌再调pH
B．步骤③中涂布时转动涂布器，使菌液在培养基上涂布均匀
C．步骤④中应挑取透明圈直径与菌落直径之比大的菌落进行培养
D．步骤⑥中若要准确计数某一时刻菌液中的活菌，应采用显微镜直接计数法
解析：制备培养基时应先调节pH后灭菌，A错误；涂布时，应转动培养皿，使涂布均匀，B错误；步骤④中，培养基中的PVA被可降解PVA的分解菌降解后，不能与碘作用产生蓝绿色复合物，会出现透明圈，故透明圈直径与菌落直径之比越大，说明菌株降解PVA的能力越强，C正确；显微镜直接计数不能区分菌体的死活，无法得到准确的活菌数目，D错误。
7．（2024·四川成都一模）工业生产中常用谷氨酸棒状杆菌的高丝氨酸缺陷型菌作为赖氨酸的发酵菌株。科研人员将紫外线照射处理过的野生谷氨酸棒状杆菌菌液（原菌液），经过程①（稀释10倍）接种在培养基甲上培养，菌落数目不再增加时如图中培养基甲。过程②表示向培养基甲中添加某种物质，继续培养。下列叙述正确的是(　C　)
A．菌落A是诱变产生的高丝氨酸营养缺陷型菌种
B．培养基甲是一种选择培养基，过程②向甲中添加赖氨酸
C．经过程①取0.2 mL菌液涂布得到甲平板所示结果，则原菌液未突变菌株浓度约为450个/mL
D．发酵结束后，将过滤得到的固体物质进行干燥即可获得赖氨酸产品
解析：野生菌种经紫外线照射处理后接种于培养基甲上，与培养基甲相比，培养基乙上菌落多，说明过程②往培养基中添加的某种物质是高丝氨酸，新出现的菌落为高丝氨酸营养缺陷型菌种，即菌落A是野生型菌种，菌落B为高丝氨酸营养缺陷型菌种，A错误；结合题图分析可知，培养基甲上只有菌落A，过程②向培养基甲中添加高丝氨酸后出现菌落B，这说明培养基甲中缺少高丝氨酸，是一种选择培养基，B错误；过程①取0.2 mL菌液进行涂布后得到的培养基甲上有9个菌落，所以菌液稀释10倍后每毫升中有未突变的菌株9÷0.2＝45（个），紫外线照射处理后的菌液中未突变的菌株浓度约为450个/mL，C正确；发酵结束后，将发酵产品采取适当的提取、分离和纯化措施来获得赖氨酸产品，D错误。
8．（2025·江苏南通模拟）研究人员为分离出产酒精能力强的酵母菌菌株，进行了如下图所示实验，甲、乙、丙、丁锥形瓶内分别加入100 mL完全培养基。相关叙述正确的是(　C　)
A．过程②涂布器蘸取酒精后立即置于酒精灯火焰上灼烧，以防酒精挥发
B．根据涂布后菌落的数目计算出葡萄酒过滤液的酵母菌密度约为6.8×109个·L-1
C．后续还需对甲、乙、丙、丁瓶中的酒精浓度和活菌数量进行检测
D．分离出的优质酵母菌菌株可用于白酒酿造，能耐受酒精度40%vol以上的发酵液
解析：过程②涂布器蘸取酒精后立即置于酒精灯火焰上灼烧，防止残留酒精影响微生物生长，冷却后用于涂布，A错误；若对微生物计数，需选取菌落数处于30～300的培养皿计数，葡萄酒过滤液中活菌的密度约为(62＋68＋74)÷3÷0.1×104×103＝6.8×109（个·L-1），但菌液中不只有酵母菌这一种微生物，故该数值不能代表酵母菌的种群密度，B错误；后续还需对甲、乙、丙、丁瓶中的酒精浓度和活菌数量进行检测，以确定分离效果，C正确；分离出的优质酵母菌菌株可用于白酒酿造，能耐受酒精度为多少还需要进一步通过实验才能确定，D错误。
9．（2025·河南濮阳模拟）谷氨酰胺酶（PG酶）是一种催化L β 谷氨酰胺水解成L 谷氨酸和氨的酶，能增大蛋白质的溶解性，提高食品工业中蛋白质的利用率。研究人员利用谷氨酰胺—甘氨酸（谷氨酰胺—甘氨酸遇热易分解）为唯一氮源从土壤中筛选产PG酶的金黄杆菌，实验过程如图所示。下列叙述错误的是(　A　)
A．该实验不仅筛选出了产PG酶的金黄杆菌，并且还对其进行了计数
B．金黄杆菌在培养基Ⅰ和Ⅲ中的生长速度高于在培养基Ⅱ的生长速度
C．培养基Ⅰ～Ⅲ中的氮源相同，三种培养基都是选择培养基
D．PG酶的活性可以用单位时间内催化L β 谷氨酰胺水解生成氨的数量来表示
解析：该实验筛选出了产PG酶的金黄杆菌，但从图中的操作看只用了一个平板，所以并没有对细菌进行计数，A错误；培养基Ⅰ和Ⅲ属于液体培养基，培养基Ⅱ属于固体培养基，微生物在液体培养基中由于和营养物质接触充分，所以代谢和繁殖效率高，故金黄杆菌在培养基Ⅰ和Ⅲ中的生长速度高于在培养基Ⅱ的生长速度，B正确；培养基Ⅰ～Ⅲ中的氮源相同，三种培养基都可以筛选产PG酶的金黄杆菌，所以都是选择培养基，C正确；由于PG酶可以催化L β 谷氨酰胺水解成L 谷氨酸和氨，所以PG酶的活性可以用单位时间内催化L β 谷氨酰胺水解生成氨的数量来表示，D正确。
10．（2025·福建泉州摸底）某兴趣小组利用碳青霉烯类抗生素进行如下实验。步骤1：将大肠杆菌接种于培养基平板上，并将平板划分为四个大小一致的区域，分别标记为①～④。①区域放入1张不含碳青霉烯类抗生素的圆形滤纸片，②～④区域各放入1张含碳青霉烯类抗生素的相同圆形滤纸片，将培养皿倒置于适宜条件下培养12～16 h。步骤2：挑取该平板上位于抑菌圈边缘菌落的细菌配制菌液，重复上述实验操作，培养至第3代，观察、测量并记录每一代的实验结果，结果如下表。下列相关叙述正确的是(　B　)
区域 抑菌圈直径/cm
第1代 第2代 第3代
② 2.26 1.89 1.62
③ 2.41 1.91 1.67
④ 2.42 1.87 1.69
A.步骤1为使用平板划线法进行大肠杆菌接种
B.抑菌圈边缘的菌落更易培养出具有抗药性的细菌
C．步骤2应取每一代直径最大的抑菌圈边缘菌落的细菌配制菌液
D．抑菌圈直径逐代减小说明大肠杆菌在抗生素的作用下产生了变异
解析：将大肠杆菌接种于培养基平板上的方法为稀释涂布平板法，A错误；本实验目的是探究抗生素对细菌的选择作用，抗生素能抑制细菌的生长，在抑菌圈边缘可能有突变后产生抗药性的菌株，B正确；由表可知，随着实验代数的增加，抑菌圈直径逐渐减小，说明细菌的抗药性逐渐增强，步骤2应取每一代直径最小的抑菌圈边缘菌落的细菌配制菌液，C错误；细菌中抗药性基因是通过基因突变产生的，抗生素对细菌抗药性的产生起选择作用，D错误。
二、非选择题（共20分）
11．（9分）（2024·广东中山一模）柑橘酸腐病是由白地霉引起的柑橘贮藏期常见的病害之一。抗菌肽是一种抑菌活性强、无环境污染的生物多肽，目前已用于多种农业病菌的防治。研究人员研究了抗菌肽对白地霉的抑菌效果，并且对其作用机制进行了探究。回答下列问题：
利用基因工程合成抗菌肽时，基本流程为克隆目的基因→导入枯草杆菌→筛选菌种→诱导抗菌肽表达→分离纯化→功能研究。
(1)白地霉从柑橘中获得其生长繁殖所需的水、无机盐、碳源和氮源等营养物质。
(2)为研究抗菌肽对白地霉的抑菌效果，现用无菌打孔器在果实相同部位打孔，每个打孔处接种相同体积的处理液，比较15天后的病斑直径。各组处理及结果见表。
组别 1 2 3 4 5
接种处理方式 接种一定体积的病原菌孢子 悬浮液 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬 浮液混合后直接接种 先加入抗菌肽溶液，2 h后接种病原菌孢子悬浮液 X 抗菌肽溶液与病原菌孢子悬 浮液混合，培养2 h后接种
15天后病斑 直径/mm 41.3 13.9 29.3 28.7 11.2
表中数据表明抗菌肽对白地霉有一定的抑菌效果，且抑菌效果与抗菌肽、病原菌孢子悬浮液接种顺序有关，表中X为先接种病原菌孢子悬浮液，2 h后再加入抗菌肽溶液。与第2组相比，第5组抑菌效果更好的原因可能是相比第2组，第5组混合后先培养2 h，使抗菌肽与病原菌孢子充分接触，更有效地发挥作用。
(3)一般情况下，电导率和离子浓度呈正相关，通过测量溶液电导率可以反映出溶液中离子浓度的大小。研究人员将白地霉孢子与抗菌肽在无菌水中混合，测定电导率，培养一段时间后，再次测定电导率，结果发现电导率明显升高，据此推测抗菌肽抑制白地霉孢子的作用机制可能是抗菌肽破坏白地霉孢子的细胞膜，使细胞内容物释放出来。
解析：(1)微生物生长一般都需要水、无机盐、氮源、碳源等营养物质。(2)根据表中接种处理方式可知，第1组只接种病原菌孢子悬浮液，为对照组，第2、3、5组均接种了等量且适量的抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液，但每组的接种顺序不同，说明自变量为抗菌肽溶液与病原菌孢子悬浮液的接种顺序。故第4组为先接种病原菌孢子悬浮液，2 h后再加入抗菌肽溶液；抗菌肽直接作用于病原菌，因此先混合培养2 h可使二者充分接触，使抗菌肽充分发挥抑菌作用，再接种后，病原菌孢子数量大大减少，引起的病斑直径减小。(3)白地霉孢子与抗菌肽在无菌水中混合培养一段时间后，溶液电导率明显上升，说明溶液中离子浓度增大，增加的离子只能来源于白地霉孢子细胞，因此推测抗菌肽抑制白地霉孢子的作用机制可能是抗菌肽破坏白地霉孢子的细胞膜，使细胞内容物释放出来，从而杀死细胞。
12．（11分）（2025·广东深圳模拟）科研人员按照如图所示流程从盐湖土壤中分离筛选出了一株高产α 淀粉酶的耐盐性菌株NWU 8，并通过He Ne激光照射提高该菌株产α 淀粉酶的能力，实验中需要a、b两种培养基，a的组分为牛肉膏、蛋白胨、高浓度NaCl、水，相比a培养基，b培养基的组分增加了可溶性淀粉。回答下列问题：
(1)配制好的培养基通常采用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法。实验小组为获得耐盐纯培养物，使用的培养基应是选择培养基（填“普通培养基”或“选择培养基”），使用的接种方法是稀释涂布平板法。
(2)为获得纯培养物的耐盐基因X，实验小组应用纯培养物提取了DNA，检测DNA所用的试剂及原理是二苯胺试剂、在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，影响DNA分子迁移速率的主要因素有DNA分子的大小和构象、凝胶浓度（答出两点即可）。
(3)要在培养基上形成菌落，a、b培养基中均还应加入琼脂，挑取a培养基平板上的菌落进一步划线纯化时，下图图示中正确的操作示意图为A。
(4)a培养基的作用是分离出耐盐微生物（耐盐菌），b培养基平板滴加碘液后，部分菌落周围出现透明圈，根据菌落直径和透明圈大小，透明圈直径与菌落直径的比值大的菌落初步判断为产酶能力较高的菌株。
(5)He Ne激光照射诱导后的菌种需要对耐盐性和产酶能力等进行检测和筛选，因为He Ne激光照射引起的变异具有不定向的特征。最后获得的纯净高产菌种进行液体摇瓶发酵，摇瓶培养的目的是增大培养液的溶氧量，利于微生物和培养液充分接触，发酵过程中可通过稀释涂布平板法检测活菌的数量。
解析：(1)为了不破坏培养基的成分，通常采用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法；根据题意，盐湖土壤中分离筛选出了一株高产α 淀粉酶的耐盐性菌株NWU 8，使用的培养基应是选择培养基，题图中显示的是平板涂布分离，故使用的接种方法是稀释涂布平板法。(2)在DNA粗提取和鉴定的实验中，检测DNA所用的试剂是二苯胺试剂，在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂会呈现蓝色。获得PCR产物后，用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶浓度等都会影响DNA分子的迁移速率。(3)要在培养基上形成菌落，a、b培养基中均还应加入琼脂，制备固体培养基，便于菌落生长和观察。平板划线时，从第一次划线的末端开始作第二次划线。重复以上操作，作第三、四、五次划线，注意不要将最后一次的划线与第一次的划线相连，故选A。(4)从题中给出的操作流程图来看，a培养基的作用是分离出耐盐微生物（耐盐菌），b培养基平板滴加碘液后，部分菌落周围出现透明圈，根据菌落直径和透明圈大小，透明圈直径与菌落直径的比值大的菌落初步判断为产酶能力较高的菌株。(5)摇瓶培养的目的是增大培养液的溶氧量，使微生物和培养液充分接触，利于其繁殖，发酵过程中可通过稀释涂布平板法检测活菌的数量。

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